澳门新萄京官方网站噬菌蛭弧菌及其死态造剂的研讨正在火产养殖上的利用

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蛭弧菌又称噬菌蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生细菌,是寄生在某些细菌并导致其裂解的一类细菌;蛭…
蛭弧菌又称噬菌蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生细菌,是寄生在某些细菌并导致其裂解的一类细菌;蛭弧菌最早是由德国的Stolp在土壤中发现的。蛭弧菌的生物学名称为噬菌蛭弧菌。蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生性细菌,具有独特的裂解细菌的生物学特性,能够在较短的时间内裂解水体中的沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、弧菌属等属的种类,可将致病菌限制在较低水平上,同时,还可有效地控制养殖水体的COD、硫化物和氨氮存留量。因此,利用这一特殊对水产养殖水体的生物净化作用和对水产养殖致病菌的生物预防具的广泛的发展前景,对开拓水产养殖动物细菌性疾病的预防途径具有重要意义。
陈家长将蛭弧菌用于河蟹养殖时发现,施用后水体中的COD、氨氮、硫化氢等含量明显降低。何进义等人1996年将蛭弧菌用于鱼类细菌性疾病的防治时发现,蛭弧菌对水体中的大肠杆菌和其他致病菌有明显去除作用,并对氨氮和亚硝酸盐等有去除作用。陈家长等人还将蛭弧菌和与光合细菌混合使用来改善养殖水质环境,25天后发现试验组较对照组的细菌数减少了3个数量级,COD、氨氮、硫化氢等都维持在较低水平。蛭弧菌能防止或减少虾、蟹病害的发生、发展和蔓延,改善虾、蟹体内外环境,促进生长,增强免疫力。因此,利用其这一特性作为水产养殖水体的生物净化物和“活性抗生素”具有广泛的发展前景,对开拓水产养殖动物疾病防治新途径具有重要意义。
一、蛭弧菌的生物学 蛭弧菌的分布与分类
国外学者Setlp和Pong分别从土壤中分离到蛭弧菌;Schoeffielda和Williams、呼兰、崔思列、马志宏等人也分别从海水、河水、人粪便及污水中发现有蛭弧菌;张宗诚、余倩等人对部分地区蛭弧菌的分布及数量进行了调查,发现蛭弧菌普遍存在,且指出蛭弧菌的数量主要与立体的温度和受污染程度有关。上述研究证明蛭弧菌普遍存在和广泛的分布状态,这为蛭弧菌的分离提取提供了可能。
蛭弧菌的分类在伯杰氏细菌鉴定手册中提到,属于薄壁菌属、共有四种:噬菌蛭弧菌、斯托普弧菌、斯塔尔蛭弧菌和一种未命名的海水菌株。
蛭弧菌的形态特征
蛭弧菌具有一般细菌的特性,较一般细菌小,能通过过滤器,有类似噬菌体的作用。革兰氏染色阴性,单细胞,呈弧状或杆状,大小为0.3~0.6×0.8~1.2微米,或仅为杆菌长度的1/3~1/4。胞浆中常可观察到致密小体,长约150~300nm,宽为70~120nm,呈片状结构。核区非常明显,周围包绕着数个核糖体颗粒。在蛭弧菌中还可以见到间体及其他许多内含物质,端生鞭毛,多为1根;有的在另一端生有一束纤毛。水生蛭弧菌的鞭毛还具有鞘膜,是细胞壁的延伸物,并乌黑有鞭毛丝状体,故比其它细菌的鞭毛粗3~4倍。蛭弧菌的鞭毛基部没有类似于其它革兰氏阴性鞭毛基部所具有的L环结构。细胞中蛋白质量可占干重的60~65%,DNA含量5%,从自然界分离的都呈依赖寄生型,与宿主细胞间常表现出一定的特异性,但有的特异性较差,能侵入多种细菌。
普遍证实蛭弧菌在适宜宿主上形成噬菌斑的PH值为5.5~9.0,最适PH值为7~8。蛭弧菌对热敏感,50℃以上时,30分钟失去活性;40℃时30分钟活性减少一半;在4~37℃条件下都有可生长,最适生长温度为25~30℃,为一类嗜中温性细菌。蛭弧菌在死菌中形成噬菌斑数是活菌的35~290倍。
蛭弧菌的宿主
1999年,杨淑专等人研究了海洋蛭弧菌对对虾病原菌和其他寄主的寄生作用,表明蛭弧菌不仅对各种弧菌、气单胞菌、邻单胞菌都有裂解作用,且对非海洋细菌如大肠杆、绿脓杆菌也有裂解作用,甚至对革兰氏阳性菌如枯草杆菌和金色葡萄球菌也能裂解。
蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用及对鲤鱼嗜水气单胞菌预防效果的研究也进一步证明了蛭弧菌对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌,且肠道病病原菌更易裂解。Pineiro等人对蛭弧菌的宿主范围进行了研究,已证实蛭弧菌对沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、弧菌属中的众多种类均有很强的裂解能力。
蛭弧菌的生活周期与生活史
国外学者对蛭弧菌的生活周期作了大量研究工作,尤其是近几年又从微观水平上对蛭弧菌的生活周期开展了大量研究工作,如Nunez等人利用原子力显微镜观察研究了蛭弧菌109J的生活周期;Rendulic等人从基因水平上对蛭弧菌的生活周期进行了研究;Beck、Barel等人研究发表了蛭弧菌宿主体内增长时产生在蛋白等。Thomashow等提出了“蛭弧菌的穿入、稳定、裂解”模型,既首先蛭弧菌通过化学趋避性识别,并吸附宿主细菌,然后通过酶解和机械钻孔等一系列反应,进入宿主细菌的质壁空间或细胞质,对宿主细胞进行一系列的修饰与改造,同时进行自身生物大分子合成,最终分裂形成子代蛭弧菌并释放到宿主细胞外。
蛭弧菌为细胞内寄生物,整个生活周期可分为识别、侵入、穿入宿主菌体、生长发育、裂解宿主、释放子代蛭弧菌。
蛭弧菌的生长过程可分为两个时期:具有1根有外鞘的极生鞭毛和高度的运动性的攻击期扩鞭毛脱落,不具有运动性的生长周期。攻击期时,其与宿主菌激烈碰撞,以没有鞭毛的一端直接吸附到宿主细菌上,菌体转动速度超过200r/s,在此之后,鞭毛脱落,然后释放出多种酶以穿透宿主细胞壁的小孔右进入到细胞内,和细胞膜之间或直接进入细胞间质中。侵入过程仅几秒钟。穿入宿主菌后,鞭毛消失,整个过程最长为60分钟。宿主菌则因渗透压改变而涨大成圆球状,且立即死亡,成为蛭弧菌的生长空间。它利用宿主的原生质为养分生长,经过一定时间后,宿主营养被完全吸收,长螺旋状的菌体均等二分裂出许多带鞭毛的子代,它们可以重新浸染宿主,开始下一个循环过程。完成这一增殖的全过程约需4~6小时。在饥饿等特殊情况下,蛭弧菌会进入囊体周期。
蛭弧菌的生态学特点
蛭弧菌在自然界的分布较广,其含量通常在夏季较高,而在冬季较低。土壤、植物根系、河水、海水、湖水、井水及下水道污水中都有蛭弧菌的分布,并能从陆生动物、水生动物或人的粪便中分离到蛭弧菌。但在清洁的自来水、泉水中很难检出。水生蛭弧菌属倾向于表面生长,是生物膜的重要组成成分。
蛭弧菌的保藏
蛭弧菌的保藏关系到其规模化生产和应用。国外的研究表明,用含宿主细胞的YP培养基保藏蛭弧菌,在4~8个月内仍有一定活性。国内的研究表明,在4℃条件下,用自来水宿主软琼脂保藏时,至少可存活3个月以上;黄文等人用4℃甘油、4℃NB液、平板、-20℃甘油和冷冻干燥等5种方法保蒇蛭弧菌,发现冷冻干燥法最好,21个月的复洗率达100%,且复活后的形状和噬菌特性不变;其次为-20℃甘油NB液保存法,17全月的复活率为67%;其它方法的保存时间也平均超过3个月。
蛭弧菌的噬菌条件
大量研究表明,蛭弧菌对PH、温度等环境因子的要求并不严格。邵桂元等人作了鱼病蛭弧菌的微生态学初步研究,发现蛭弧菌Bds-4等菌株在4~37℃和PH6.0~8.0的条件下,对点状产气单胞菌有形成噬菌斑的能力。李戈强等人经研究指出,蛭弧菌在温度10~35℃和PH6.5~8.1的范围内,对河流蛭弧菌均有裂解作用;在25~30℃和PH6.5~8.1时的裂解作用最强。马志宏等人也经过研究认为蛭弧菌对环境条件的适应性强,对温度和PH的适应范围较广。
蛭弧菌的除菌效果
秦生巨等人的研究认为,蛭弧菌在河水中21天后,可使不凝集弧菌由4.46×106个/ml降到27个/ml。杨莉等人的研究结果发现,蛭弧菌对鲤鱼感染嗜水气单胞菌的裂解效果,蛭弧菌在5天后使嗜水气单胞菌的浓度下降了103cfu/ml,9天后下降了107cfu/ml。说明蛭弧菌的除菌效率高。
蛭弧菌的安全性
迄今为止,已有一些报道说蛭弧菌对人和某些动物无害。薛恒平、秦生巨等人曾报道蛭弧菌能够促进仔鸡生长,提高增重率;冯晓英等的研究表明,在注射0.02ml浓度为8×105pfu/ml的蛭弧菌后,观察72小时,实验小鼠全部存活,无任何病态,生长良好;Byrd等人也认为,蛭弧菌对人无致病性。但蛭弧菌对水产动物的安全性尚未进行更多的研究。

中国水产门户网报道噬菌蛭弧菌是Stolp和Petzold1962年[1]首次在德国的土壤中于一种植物假单胞菌上发现的一类细菌的寄生菌。它比通常的细菌要小,有似细菌病毒的作用,但不是病毒,具有细菌的特性。“寄生”和“裂解”宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。1982年[2]作者等在我国首次发现并及时报道了蛭弧菌的研究。近半个世纪来,国内外许多研究人员对蛭弧菌的分类学、细胞学、免疫学、生理学、生物化学、分子生物学、生态学以及蛭弧菌与宿主菌的相互作用等进行了系统的研究。至今已发表论文800余篇。蛭弧菌的基本特性蛭弧菌的基本特性可概括为如下几点:一般呈弧、杆状,有时呈螺旋状;菌体狭小,宽约0.3-0.45μm;⑶端生鞭毛,很少多于1根,鞭毛带鞘,并着生于一端;⑷革兰染色呈阴性;⑸严格好气;⑹化能有机型;⑺含有DNA,并具有高度同源性,G+C含量为42%-51%;⑻明显而稳定地分解蛋白质;⑼通过TCA循环进行代谢;⑽一般不能分解利用碳水化合物,而利用肽、氨基酸作为碳源和能源。不能利用环境提供的营养而生长,必须在宿主菌细胞内或其抽提物中才能生长、发育、繁殖,最后使宿主菌裂解;⑾具有双形性的发育史,有鞭毛交替,捕食性的类弧菌游动子(能用鞭毛尖端附着寄生细胞),无鞭毛螺旋状营养阶段;⑿能够进入到宿主细菌内,并在那里发育、繁殖或具有某种遗传力。其中寄生性和溶菌性是蛭弧菌一个重要的标志。蛭弧菌的理化特性蛭弧菌生长要求的pH为6.0-8.5;温度为20-37℃,4℃,42℃时则不生长;能使明胶液化;在人工培养基上产生黄色色素、细胞色素a、b、c,还能产生各种酶类:如胞外酶,诱导损伤寄主细胞溶解和消化,蛋白酶,酯酶,促使细胞壁降解,并可利用寄主细胞质中的内含物;蛭弧菌不能利用碳水化合物,它是利用多肽及氨基酸作为能源和碳源的;蛭弧菌生长代谢过程中乙醛酸循环不明显,以不完全的三羧酸循环为主要代谢途径;蛭弧菌蛋白质含量极为丰富,可达干重的60-65%,DNA含量为5%,含有典型的嘌呤和嘧啶;蛭弧菌DNA合成的前体物质,全部来自宿主菌细胞,大约70%来源于宿主DNA,30%来源于RNA;蛭弧菌可直接利用单核苷酸作前体物质,合成其核酸;蛭弧菌在吸附、侵染、穿入等的整个生命周期中,需要多种酶类的参加;蛭弧菌的鞭毛,粗且带鞘,早期有人认为,鞭毛鞘是由细胞壁外膜组成,对尿素十分敏感;伯杰细菌鉴定手册已把蛭弧菌列入螺菌科位置不定的属——蛭弧菌属。蛭弧菌的生态学及在自然界中的作用蛭弧菌广泛存在于自然界,土壤、河水、近岸海水以及下水道的污水中都有它们的分布,可是干净的井水、矿泉水、自来水中都很难找到蛭弧菌的存在。一般污水中含量为105PFU/ml,土壤中含菌数为103-105PFU/g,淡水、海水中含菌量仅为50PFU/ml。据日本报道下水道污水中含蛭弧菌含量可高达每毫升数万个。然而它们在自然界究竟起什么作用呢?有人归纳为两个方面:⑴由于蛭弧菌具有寄生和溶菌能力,所以有可能利用这种拮抗作为同致病菌作为斗争的有力武器。有实验指出,将浮游球衣菌和水稻白叶枯病菌加入灌溉水中,便成为蛭弧菌的“食料”,结果致病菌大大减少了。另外,蛭弧菌还对大豆疫病假单胞菌有较强的侵染力。⑵由于这类菌广泛存于污水中,它对污水中常见的大肠菌具有寄生性,同时对污水中的弧菌属、志贺菌属、沙门菌属等细菌消除亦起重要作用,因此有人把蛭弧菌作为河流水域污染程度的一项最好指标。另一方面,它在水源自净方面无疑也起着十分重要的作用。苏联Pushchino污水处理厂用蛭弧菌净化污水的研究已取得成果。近年来,许多实验室对蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然环境河水中的某些肠道致病菌方面,做了许多卓有成效的探索工作。目前已证实,蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属、球菌属等均有很高的裂解活性,特别是对弧菌属、沙门菌属和志贺菌属。进一步研究发现,蛭弧菌对自然河水中的副溶血弧菌,溶藻弧菌,海弧菌,河弧菌,鳗弧菌,拟态弧菌,嗜水气单胞菌,恶臭假单胞菌,屈挠杆菌,发光杆菌,伤寒沙门菌,大肠杆菌,等均有显著的净化作用。本文就蛭弧菌的研究及生态制剂在水产养殖上的应用阐述如下。1蛭弧菌的研究1.1蛭弧菌生物学特性的研究蛭弧菌的噬斑透明,无菌落形成。蛭弧菌的菌株不同,其噬菌斑的形态、大小也不同,大的直径可超过15mm,小的直径只约0.5mm,而且可随培养时间的延长而扩展。蛭弧菌培养于4℃环境中,大多数蛭弧菌可出现噬菌斑。在液体中培养、增殖蛭弧菌,蛭弧菌能侵染、裂解宿主菌,3-5天使浓厚的宿主菌悬液裂解、澄清,蛭弧菌的数目增加。但是用这种方法增殖蛭弧菌,很难得到高效价的蛭弧菌培养物,即使在澄清的蛭弧菌培养液中反复的补充宿主菌,也不能达到高效价的增殖蛭弧菌的目的,原因尚不清楚,有待进一步研究。蛭弧菌噬菌斑革兰染色高倍镜观察,可见典型的、多量的革兰阴性、小的弧或杆状细胞。蛭弧菌噬菌斑悬滴相差显微镜下可见到运动极其活泼,呈跳跃式积极追捕宿主的蛭弧菌细胞,在相差显微镜下,可以连续观察到蛭弧菌吸附、侵染、进入、增殖、生长、裂解宿主细胞的全过程。电子显微镜负染透射镜观察,可见到弧状或杆状蛭弧菌细胞,细胞一端有一长的单鞭毛。还可见到蛭弧菌吸附在宿主菌细胞上的典型形态。超薄切片电镜观察,可见到蛭弧菌在细胞内生长、繁殖的结构。pH对蛭弧菌生长及噬菌斑形成有明显的影响,虽然pH在3.0-9.8的自来水宿主菌双层琼脂平板上均可形成噬菌斑,而pH7.6最为适宜。呼兰等从人粪便分离获得的蛭弧菌最适pH为7.0,pH9.0不能形成噬菌斑,其原因有待进一步检查。蛭弧菌在4-37℃环境中形成噬菌斑,20-30℃时对大多数菌株的噬菌斑形成更为适宜。少数菌株37℃更为适宜。人粪便中分离的蛭弧菌也是以37℃最为适宜。在4℃冰箱中也能形成噬菌斑,但需较长时间。近来研究发现,极少数菌株可诱导至43℃中生长。从自来水宿主双层琼脂平板中蛭弧菌形成噬菌斑数目来看,蛭弧菌生长繁殖的最为适宜温度为25℃。温度较高,如37℃时蛭弧菌数目反而逐渐减少,并失去活力。但于4℃冰箱中可继续生存,培养至第4天增殖数量为最高,此后反而减少。蛭弧菌培养物不耐热,如蛭弧菌Bd81、Bd98,15-25℃以上时乃呈渐渐失活的现象,如以25℃2小时,蛭弧菌的活存数目为100%计,则15-20℃时呈较为稳定状态,存活数分别为94.9%-100%;30,35,40,45及50℃是时存活率依次为78.0%,62.7%,40.7%,30.5%和0%。蛭弧菌在污水自净过程中参与作用的研究结果证明,蛭弧菌裂解作用可降低污水中异养性革兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量。这种裂解活性明显地受温度影响,因为温度可影响寄生菌与宿主菌之间相互作用的速度,在水温为26℃时寄生物/宿主的指数最大,而在19℃时最小。当污水在26℃时,沉淀池污水中含大肠杆菌为800CFU/ml,而在19℃时,含大肠杆菌为4000CFU/ml,污水中相互作用的微生物数量发生变化,这是典型的P/H的关系。这些研究结果证明,在污水自净过程中,蛭弧菌在26℃环境河水中可以有效地参与清除肠道微生物群,而在23.5℃时清除率低。蛭弧菌于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上可比在未经处理的活的宿主菌双层琼脂平板上更迅速的形成噬菌斑,后者一般需40-48h才可出现噬菌斑。在加热及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h,形成噬菌斑的数目也大大增多。例如在100℃加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍,Bd98增加约72倍,在80℃加热致死的宿主菌中Bd81增加151倍,Bd98增加73。氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍,Bd98增加67倍。在这些宿主菌的琼脂平板中形成的噬菌斑也明显的小于在活菌平板上,形成噬菌斑的时间也较快(Bd81为28h,Bd98为36h),数量也有增加或没有增加。在抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄青霉素及多粘菌素B)处理失活的宿主菌双层琼脂平板上,形成噬菌斑的时间差别不大,噬斑的数量与在活菌宿主菌双层琼脂上也不增加或差别不大。实验结果证明,在加热致死的宿主菌上生长增殖的蛭弧菌,再接种在活的宿主菌琼脂平板上仍然恢复其生长特性和裂解的活力。1.2蛭弧菌对不同科属细菌的宿主范围从8株蛭弧菌在不同科属24株菌的琼脂平板上形成噬菌斑的能力试验中,发现蛭弧菌的宿主范围均较广,都可在自来水宿主双层平板中裂解较多不同科属的革兰阴性菌株及部分阳性菌株,于48h产生噬菌斑,从宿主范围看,不同的蛭弧菌株对宿主的选择并不相同。司穉东等报道,蛭弧菌不但对人类病原菌有裂解作用,而且对许多植物病原菌也有较强的噬菌能力。如从上海近郊河水中分离的蛭弧菌对大豆疫病假单胞菌,白菜软腐菌和水稻白叶枯病黄单胞菌等均有较突出的裂解功能。实验亦已证实,以10亿个菌的剂量对小鼠、豚鼠、家兔等不存在毒力和毒性作用。就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。有人指出,蛭弧菌外用有预防部分动物角膜炎的效果。呼兰、刘秉阳用福氏志贺菌感染豚鼠角结膜,并同时滴加蛭弧菌107PFU。结果发现15只感染的豚鼠眼中有6只未发病,得到保护,其保护率为40%。另外部分未获得保护的豚鼠眼是否由于福氏志贺菌感染用量较大或其他原因,有待进一步探索。1.3蛭弧菌培养物保藏方法的研究蛭弧菌于灭菌自来水中,4℃环境中保存,大部分蛭弧菌存活8个月以上,极少数菌株仅存活2个月。在自来水保存液中定时添加宿主菌,保持一定浓度,并不能使蛭弧菌不断增殖而延长时间。蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中,于4℃环境中存活时间。发现91天蛭弧菌的存活菌株占100%,157天或188天占91.7%,240天占67.7%,31天占58.3%,372天占50.0%,411天占25.0%,548天占16.7%,600天时全部检不出蛭弧菌。用脱脂牛奶作保护剂冷冻干燥于4℃冰箱保存蛭弧菌培养物,两年的存活率为100%,3年的存活率为81.8%。以上3种方法保存的蛭弧菌次代培养物的生物学特性和寄生、裂解宿主菌的能力均不发生改变。2蛭弧菌生态学的研究2.1蛭弧菌在动物体内的分布现已证明,蛭弧菌在马、牛、猪和鸭等动物肠道中都可检出,并经常随粪便排出体外到外环境中,其蛭弧菌的含量较低,一般在1-200PFU/ml。同一研究,在人体、小鼠、蚌和鱼体内的粪便中没有检出蛭弧菌,这可能与检索的样本数较少有关。2.2蛭弧菌在自然水中的分布及数量调查水样325份,检出阳性254份。蛭弧菌在这些样品中的含量为1-5880PFU/ml或g。海泥的含量为2-246PFU/g;湖水中含量为2-268PFU/ml;河水中含量为1-5880PFU/ml。蛭弧菌在自然界中分布非常广泛,一般说来,凡有细菌存在的地方都有它们的存在,特别是污水环境中它们的分布较为普通。但是蛭弧菌在环境中的分布及其变化与季节和河水污染程度有关。夏季较多,冬季、春季分别为夏季的16.6%和44.8%。2.3蛭弧菌噬菌体蛭弧菌可使一些细菌遭到毁灭性的溶解,可是蛭弧菌本身也受另一类生物的威胁,那就是蛭弧菌噬菌体(bdellophage)。它们对寄生性和非寄生性的蛭弧菌都有裂解作用。然而,蛭弧菌噬菌体具有严格的专一性,并有其影响蛭弧菌裂解过程的作用。当蛭弧菌直接吸附宿主菌之前,或在完全侵入宿主周质之前,蛭弧菌噬菌体尾部首先吸附在蛭弧菌细胞上,然后,该噬菌体的核酸注入到蛭弧菌中,便完成它对宿主细菌的侵入,头部完全以空壳保留在细胞外,感染特异性噬菌体的蛭弧菌仍保持其原来的状态和大小,蛭弧菌噬菌体在蛭弧菌细胞中生长繁殖,而蛭弧菌本身仍处于宿主菌细胞中,结果导致蛭弧菌的宿主细胞破裂,此时,蛭弧菌噬菌体被释放到体外。2.4蛭弧菌对水体中细菌净化作用的研究蛭弧菌能寄生和裂解细菌,可否利用这一特殊的生物特性作为以菌制菌的手段?!2.4.1蛭弧菌在水中对宿主菌的净化作用蛭弧菌在灭菌湖水中,对宿主福氏志贺菌有显著的清除作用,如7天时福氏志贺菌被清除92.8%,或97.4%。不同数量蛭弧菌于灭菌湖水中25℃时,对浓度为5.0×106-8.0×106CFU/ml弧菌均有净化作用,且随着蛭弧菌与ElTor霍乱弧菌投入比的增加,ElTor霍乱弧菌被清除的速率也增快,以5.0×106-8.0×106CFU/mlElTor霍乱弧菌清除到活菌计数为0时,投入比约为1:100000时需24天,约为1:10000时需18天。蛭弧菌于灭菌湖水中25℃时,对大肠杆菌悬液亦有除菌效果。如第21天,加有蛭弧菌湖水中的大肠杆菌由原来的3.5×107CFU/ml,减少到11CFU/ml。模拟自然条件的河水中蛭弧菌可使河水2天后变为澄清透明,6天后加有蛭弧菌和ElTor霍乱弧菌试验组的河水也变为澄清透明,但只加蛭弧菌的河水清澈。蛭弧菌对模拟自然条件河水中革兰阴性菌的裂解率显著高于阳性菌的裂解率。因此蛭弧菌作用于河水中的细菌时,可以使河水中阴性菌迅速减少,减少的数目也多,阳性菌也有减少,但不及阴性菌,如11天及13天时,加蛭弧菌的试验组,河水中的阴性菌由原来的98%减少到64%及56%,而不加蛭弧菌对照组河水中的革兰阴性菌由原来的96%减少到94%及78%。蛭弧菌可以净化水体中的细菌,这是无疑的。但蛭弧菌在净化细菌时,受多方面因素的影响,如温度、pH、生物等,其中蛭弧菌的量和蛭弧菌与宿主细菌的比例也是众多的影响因素之一。有人认为,蛭弧菌要发挥净化河水中细菌的功能,其在河水中的含量必须要达到102-103PFU/ml,否则,效果极差甚至达不到净化的目的。蛭弧菌与宿主菌的比例以1:1000较为合适。比例过高或过低蛭弧菌和宿主菌的消长很不明显。2.4.2蛭弧菌在对自然河水净化过中河水中理化指标的变化进一步检查河水的浊度单位,加蛭弧菌河水中的浊度单位也逐渐降低,如实验结束时,加有蛭弧菌河水的浊度由原来的40下降到10,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的浊度单位由原来的40下降到25。加蛭弧菌的河水生物耗氧量随着自然河水的逐渐净化而降低,如加蛭弧菌的试验组河水的生物耗氧量开始为7.6mg/L,到实验终末时减少到3.4mg/L,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的生物耗氧量由原来的7.5mg/L仅降低到5.7mg/L。在整个试验过程中,pH、氧化物、总硬度、钙、镁的含量都发生了一系列改变。推测这一系列理化指标的改变与蛭弧菌净化宿主菌的活动有密切关系,但这些变化是否为蛭弧菌净化河水的规律或客观指标,还有待进一步的研究。3蛭弧菌微生态制剂的研究及在水产养殖上的应用1989年秦生巨等[3]首次从太湖养殖珍珠的三角帆蚌中分离出9株嗜水气单细胞菌,随后进行了10株蛭弧菌对9株嗜水气单细胞菌裂解作用的研究。结果发现蛭弧菌对嗜水气单细胞菌的裂解率在80%以上。1991年秦生巨、刑华等进行蛭弧菌微生态制剂对淡水鱼细菌病防治的研究。1994年国家农业部正式批准“噬菌蛭弧菌微生态制剂”为二类新兽药。2005年农业部发布的国家兽药品种编号,噬菌蛭弧菌微生态制剂列为7027号。1995年邵桂元,洪黎民以鲫鱼出血性腹水病病原菌点状产气单胞菌为宿主。从自然界分离获得6株噬菌蛭弧菌菌株。研究表明,这6株蛭弧菌能裂解多种鱼类病原菌。1996年秦生巨等在上海奉贤利用蛭弧菌微生态制剂防治中国对虾的细菌病,并取得了满意的结果。1996年黄琪琰、秦生巨用蛭弧菌微生态制剂防治甲鱼,河豚鱼细菌病的试验,结果证明,60天试验结束时,蛭弧菌微生态制剂可降低由人工感染引起的甲鱼、河豚鱼嗜水气单胞菌败血症的发病率85.5%,死亡率93.3%,提高增重率16%。1997年杨淑专、黄庆辉报道,用宿主双层琼脂平板法,测定海洋蛭弧菌对25株对虾病原菌,绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌的寄生作用,结果表明蛭弧菌菌株不同寄生的范围不同,但所有供试寄主细菌都能被某些蛭弧菌寄生,形成清晰的噬斑。1999年马志宏调查了北京地区25份水样,其中24份检出蛭弧菌,试验选用4株鱼类主要致病菌为宿主菌,检出的蛭弧菌对上述4种细菌的裂解范围有所不同,其中嗜水气单胞菌可被全部检出的蛭弧菌裂解,其他3株菌仅部分被裂解,依次为肠型点状气单胞菌,荧光假单胞菌,鳗弧菌。2000年杨莉,王秀茹以不同浓度的蛭弧菌投放水族箱中,对鲤鱼用浸泡法进行人工感染嗜水气单胞菌试验。试验结果表明,蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解和净化作用,对水中氨氮有一定的降解作用,并且对鲤鱼感染嗜水气单胞菌所致暴发性出血病有明显的预防作用。2001年中国海洋大学唐洛明[4]实验证明,蛭弧菌微生态制剂可以提高对虾育苗的成活率20%以上;可以推迟发病25天以上;增产增收明显;与抗生素相比,在水质改善方面有明显的作用,水质清新活爽,有绿色环保的功效。2001年中国水产科学院黄海所徐健等[5]将球形红假单胞菌、噬菌蛭弧菌及粘红酵母予以不同搭配,得到4种微生态制剂,加入中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)幼体培育水体中,研究其对中国对虾幼体生长和非特异性免疫的影响。结果表明,使用这4种微生态制剂均极显著提高幼体变态率,存活率提高16.86%-34.22%,体长增加0.64-1.29mm;M1-P5期的体长平均增长率也高出17%-40%;酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力也显著高于对照组。其中添加蛭弧菌和球形红假单胞菌试验组的效果最好。试验中球形红假单胞菌和蛭弧菌联合使用则比对照组高出34.22%,这体现了菌种配伍的优势。在养殖中还发现试验组的虾苗个体大、均匀、健壮,而对照组幼体个体大小不一,存在残食现象。蛭弧菌和球形红假单胞菌联合使用在各方面都表现出协同作用,显示出其联合使用的优势。此组中球形红假单胞菌菌体含有60%以上的蛋白质,富含多种维生素,特别是VB12、叶酸和生物素,是酵母中含量的几千倍。此外,还有抗病毒的生长因子辅酶Q,含量是酵母的13倍,是幼体适口的饵料。蛭弧菌则对病原菌有很强地裂解作用,二者联合能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物质,这在营养、水质和防治病害上都有力保障了此组在各项指标上处于优势。2004年张梁等[6]研究了蛭弧茵对养殖草鱼水体主要水化指标的影响。试验结果表明:蛭弧菌对养殖环境的主要水化指标具有明显的改善作用,试验组的平均COD、NH3-N、硫化物值显著低于对照组,试验组的DO显著高于对照组,而试验组与对照组的pH值差异不显著,同时提示在养殖草鱼水体中,全池泼洒10mL/m3的蛭弧菌,可有效改善水质。2004年曾地刚等利用蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰细菌性败血病试验。结果证明,在试验水体中加入嗜水气单胞菌对斑点叉尾鮰进行感染,同时在水体中加入噬菌蛭弧菌,当水中的噬菌蛭弧菌浓度达到105cfu/ml以上时有预防斑点叉尾鮰败血病的效果。2005年刘恒义、秦生巨等[7]利用复合蛭弧菌微生态制剂治疗大菱鲆由弧菌引起的重症出血病,结果证明,连续使用复合蛭弧菌微生态制剂3天,267尾严重出血的大菱鲆治愈率为98.7%,效果非常明显。事实证明,近20年,尤其是本世纪以来,蛭弧菌及其微生态制剂在水产养殖上的应用和研究速度惊人,成果颇丰。4未来10年蛭弧菌在水产养殖方面的研究方向及展望自1979年我国开展对蛭弧菌的研究以来,蛭弧菌的研究进展很快,取得了不少成果。至今已公开发表论文200余篇。但蛭弧菌及其制剂在水生动物上的应用还需要进一步的研究;甚至是很艰苦的探索工作。近年来我国已有许多实验室相继开展了这项工作。利用蛭弧菌净化养殖水体,控制或减少水生动物疾病的发生和流行,运用生物之间的相互拮抗作用,开展水生动物相关疾病的生物防治已受到水产工作者的重视,并进行了广泛的研究。利用微生态制剂防治动物的相关疾病,解决动物源性食品中药物残留对人类的危害,近年来已成为人们关注的热点。蛭弧菌在水生动物疾病防治中的作用,已引起众多研究者的兴趣和关注,也被公众逐步认知,并在日益接受。实验研究已证明,蛭弧菌对许多种属的细菌有清除作用。今后的研究方向,主要是如何将蛭弧菌推广应用于自然环境水体净化,以改善养殖水源,保护环境,控制或减少水生动物疾病的发生,解决动物源性食品中药物残留,造福于人类。但这项技术人们必须从以下几方面进一步去研究。4.1蛭弧菌在自然环境中与其它生物的关系蛭弧菌在自然环境中与其它生物的关系,特别对养殖水体中致病菌自净作用是个极其重要而具有意义的生物学和生态学问题,值得很好的探究。4.2蛭弧菌生态制剂生产用菌株研究已证实,蛭弧菌的宿主范围广泛,它在养殖水体中对致病菌发生裂解和溶解的同时,如何不侵袭有益菌?!海水和淡水含的物质不一样,养殖的水生动物品种不一样,主流菌群也不一样。蛭弧菌生态制剂生产用菌株如何选择?4.3蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌“三位一体”的寄生体系是独特的。这一现象值得注意,对这一现象进一步的研究可能是有意义的。4.4噬藻蛭弧菌[8]近年来在蛭弧菌分类学的研究中发现,除上面3种蛭弧菌以外的一些新种,如噬藻蛭弧菌(Bd.chlorellovorus)等,它们可使藻类的弧状体裂解而逐渐死亡。这一发现对水生动物疾病的防治无疑是有益的,人们应深入研究。4.5生产用蛭弧菌株的筛选高产量蛭弧菌株的选择以及生物制剂的生产,实验用蛭弧菌显然不宜作为生物制剂生产用菌株;而且蛭弧菌的增殖需大量的宿主菌的营养来源,所以蛭弧菌生物制剂的生产工艺不同于一般生物制剂的生产。生物制剂的生产菌种,国际通用的法则,生产菌种必须经过严格的鉴定、分类,确保其生物学原型。凡是生物物种经过反复人工传代都有发生突变的可能。早在1975年Starr就发现蛭弧菌的突变株,目前所知,野生菌株几乎都在宿主细胞内生存的。但对其衍生菌株(兼性及不依赖于宿主细胞)的研究,特别是对其突变株的研究用于描述蛭弧菌代谢机制是具有重要的意义和指导实践价值的。突变后的蛭弧菌有可能回复致病性,这种致病性往往是超强的,这种疾病往往让人类猝不及防。“非典”、“禽流感”不能不引起人们的反思。目前国内蛭弧菌生态制剂的生产、销售的盲从和无序,人们应慎重从事,不能对社会不负责。4.6蛭弧菌生物制剂的剂型及使用途经目前蛭弧菌生态制剂局限于液体制剂,液体制剂在实际使用上可能是方便的,但运输和保存是不利的。蛭弧菌生态制剂冻干粉剂的技术国内外均有成功的报道,如何去利用这项技术,关键是超滤浓缩。如蛭弧菌发酵液经过超滤浓缩、冻干,利用蛭弧菌生态制剂冻干粉剂制成半悬浮状的微型胶囊,在水生动物疾病的防治中更为重要。现在蛭弧菌液体制剂使用途经有泼洒、拌料内服、浸泡,是否有更为有效地途经应该探讨。4.7分子遗传学的研究4.7.1遗传工程目前,遗传工程已成为生物科学中的一门最引人瞩目的学科,1978年美国分子生物学家借助于人工合成的限制性内切酶,从大肠杆菌的染色体上剪去一段DNA,然后把能合成人胰岛素的基因,以质体为运载工具移接到大肠杆菌的染色上,细菌在恢复生长后,便具有合成人工胰岛素的能力。蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌系统是引人注意的独特的“三位一体”的寄生体系,并可利用宿主菌DNA合成蛭弧菌子代,这已经被研究证明。如能从某一致病菌的染色体上切去一段DNA,移接一段蛭弧菌基因到致病菌的染色上去,使致病菌丧失致病力而仍保持抗原特性,然后再用该菌株生产菌苗或用于其他生物学的研究,可能是有意义的探索。4.7.2溶菌物质蛭弧菌对宿主细胞的裂解特性,长时间以来,一直被人们关注。对蛭弧菌的裂解机制也进行了大量的研究工作。1978年Thomashow等提出的“蛭弧菌穿入、稳定、裂解”模型较有代表性。参与这一过程的主要酶包括:聚糖酶,蛋白酶,N-脱酰基酶、酰基转移酶,Braun去脂蛋白酶,裂解经修饰的肽糖酶,脂酶,溶菌酶等。聚糖酶及脂蛋白酶只是在蛭弧菌“穿入”时有活性,而蛋白酶在蛭弧菌的大部分生活期间有活性,但活力不断下降。这三种酶在蛭弧菌“钻孔”中起了作用。N-脱酰基酶、酰基转移酶的作用是维持蛭弧菌小体的稳定,能使之抗渗透压,不被破坏。去Braun脂蛋白酶主要是通过修饰底物细胞壁,使聚糖酶作用消失,而完成这一功能。当蛭弧菌在周质中生长时成熟后,蛭弧菌合成一种新的酶,其功能是完全裂解修饰的肽聚糖,其作用位点于肽聚糖中不可缺少的氨基糖连接键。从而释放子代蛭弧菌。有人发现,用蛋白质合成抑制剂,如链霉素、嘌呤素及氯霉素等,可抑制蛭弧菌的穿入。据此认为,蛭弧菌穿入时宿主细胞壁破坏还有诱导酶的产生,诱导物存在于宿主细胞内。Fackeell等报到,蛭弧菌穿入宿主细胞时,至少有溶菌酶、胞壁酸酶及酯酶等,Bd6-5-S还可释放两种多肽酶,分子分量为40kDa及100kDa。Michael等研究证明,当蛭弧菌穿入宿主时,聚糖酶及多肽酶的活性很高,短时间内溶解宿主菌10%-15%的肽聚糖。聚糖酶溶解肽聚糖中的氨基糖,多肽酶水解肽聚糖中的二氨基庚二酸、大约30%二氨基庚二酸残基被水解。穿入过程结束时,这两种酶的活性明显降低或消失。与此同时在脂多糖中25%的葡萄糖胺被一种分子量小于2kDa的酶水解,该酶在穿入结束时,也不起任何作用。为此,许多人认为,酶是蛭弧菌穿入宿主细胞壁的主要因子。5结束语进一步研究蛭弧菌在生物防治中的作用是专家们近年来一致呼吁的。蛭弧菌对宿主特异性不强,工、农、医微生物都有被“寄生”和“裂解”的可能。因此,我们研究蛭弧菌,应扩大其研究范围,不应过多的重复研究。推测用蛭弧菌对工、农、医的生物防治以及环境保护,其前景是诱人的,将会产生较大的社会效益和经济效益。

中国水产门户网报道蛭弧菌的生物学名称为噬菌蛭弧菌。蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生性细菌,具有独特的裂解细菌的生物学特性,能够在较短的时间内裂解水体中的沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属、这形杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属、弧菌属等属的种类,可将致病菌限制在较低水平上,同时还可有效地控制养殖水体的COD、硫化物和氨氮存留量,因此,利用其这一特性作为水产养殖水体的生物化物和“活性抗生素”具有广泛的发展前景,对开拓水产养殖动物疾病防治新途径具有重要意义。一.蛭弧菌的生物学蛭弧菌的分布与分类国外学者Setlp和Pong分别从土壤中分离到蛭弧菌;Schoeffielda和Williams、呼兰、崔思列、马志宏等人也分别从海水、河水、人粪便及污水中发现有蛭弧菌。张宗诚、余倩等等人对成才地区蛭弧菌的分布及数量进行了调查,发现蛭弧菌普遍存在,且指出蛭弧菌的数量主要与立体的温度和受污染程度有关。上述研究证明蛭弧菌普遍存在和广泛的分布状态,这为蛭弧菌的分离提取提供了可能。蛭弧菌的分类在伯杰氏细菌鉴定手册中提到,属于薄壁菌属、共有四种:噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriouorus简称Bd菌)、斯托普弧菌(Bd.stolpii)、斯塔尔蛭弧菌(Bd.starrii)和一种未命名的海水菌株。蛭弧菌的形态特征蛭弧菌具有一般细菌的特性,较一般细菌小,能通过过滤器,有类似噬菌体的作用。革兰氏染色阴性,单细胞,呈弧状或杆状,大小为um×um,或仅为杆菌长度的l/3~l/4。胞浆中常可观察到致密小体,长约150nm~300nm,宽为70nm~120nm,呈片状结构。核区非常明显,周围包绕着数个核糖体颗粒。在蛭弧菌中还可以见到间体及其他许多内含物质,端生鞭毛,多为l根。有的在另一端生有一束纤毛。水生蛭弧菌的鞭毛还具有鞘膜,是细胞壁的延伸物,并乌黑有鞭毛丝状体,故比其它细菌的鞭毛粗3倍~4倍。蛭弧菌的鞭毛基部没有类似于其它革兰氏阴性鞭毛基部所具有的L环结构。细胞中蛋白质量可占干重的60%~65%,DNA含量5%,从自然界分离的都呈依赖寄生型,与宿主细胞间常表现出一定的特异性,但有的特异性较差,能侵入多种细菌。普遍证实蛭弧菌在适宜宿主上形成噬菌斑的pH为5.5~9.0,最适pH为7~8。蛭弧菌对热敏感,50℃以上时,30分钟失去活性;40℃时30分钟活性减少一半。在4℃~37℃条件下都有可生长,最适生长温度为25℃~30℃,为一类嗜中温性细菌。蛭弧菌在死菌中形成噬菌斑数是活菌的35倍~290倍。蛭弧菌的宿主l999年,杨淑专等人研究了海洋蛭弧菌对对虾病原菌和其他寄主的寄生作用,表明蛭弧菌不仅对各种弧菌、气单胞菌、邻单胞菌都有裂解作用,且对非海洋细菌如大肠杆、绿脓杆菌也有裂解作用,甚至对革兰氏阳性菌如枯草杆菌和金色葡萄球菌也能裂解。蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用及对鲤鱼嗜水气单胞菌预防效果的研究也进一步证明了蛭弧菌对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌,且肠道病病原菌更易裂解。Pineiro等人对蛭弧菌的宿主范围进行了研究,已证实蛭弧菌对沙门氏菌属、志贺氏菌属、这形杆菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、弧菌属中的众多种类均有很强的裂解能力。蛭弧菌的生活周期与生活史国外学者对蛭弧菌的生活周期作了大量研究工作,尤其是近几年又从微观水平上对蛭弧菌的生活周期开展了大量研究工作,如Nunez等人利用原子力显微镜观察研究了蛭弧菌109J的生活周期;Rendulic等人从基因水平上对蛭弧菌的生活周期进行了研究;Beck、Barel等人研究发表了蛭弧菌宿主体内增长时产生在蛋白等。Thomashow等提出了。蛭弧菌的穿入、稳定、裂解”模型,即首先蛭弧菌通过化学趋避性识别,并吸附宿主细菌,然后通过酶解和机械钻孔等一系列反应,进入宿主细菌的质壁空间或细胞质,对宿主细胞进行一系列的修饰与改造,同时进行自身生物大分子合成,最终分裂形成子代蛭弧菌并释放到宿主细胞外。蛭弧菌为细胞内寄生物,整个生活周期可分为识别、侵入、穿入宿主菌体、生长发育、裂解宿主、释放子代蛭弧菌。蛭弧菌的生长过程可分为两个时期:具有1根有外鞘的极生鞭毛和高度的运动性的攻击期扩鞭毛脱落,不具有运动性的生长周期。攻击期时,其与宿主菌激烈碰撞,以没有鞭毛的一端直接吸附到宿主细菌上,菌体转动速度超过200r/s,在此之后,鞭毛脱落,然后释放出多种酶以穿透宿主细胞壁的小孔右进入到细胞内,和细胞膜之间或直接进入细胞间质中。侵入过程仅几秒钟。穿入宿主菌后,鞭千周消失,整个过程最长为60分钟。宿主菌则因渗透压改变而涨大成圆球状,且立即死亡,面为蛭弧菌的生长空间。它利用宿一的原生质为养分生长,经过一定时间后,宿主营养被完全吸收,长螺旋状的菌体均等二分裂出许多带鞭毛的子代,它们可以重新浸染宿主,开始下一个循环过程。完成这一增殖的全过程约需4小时~6小时。在饥饿等特殊情况下,蛭弧菌会进入囊体周期。蛭弧菌的生态学特点蛭弧菌在自然界的分布较广,其含量通常在夏季较高,而在冬季较低。土壤、植物根际、河水、海水、湖水、井水及下水道污水中都有蛭弧菌的分布,并能从陆生动物、水生动物或人的粪便中分离到蛭弧菌。但在清洁的自来水、泉水中很难检出。水生蛭弧菌属倾向于表面生长,是生物膜的重要组成成分。蛭弧菌的保藏蛭弧菌的保藏关系到其规模化生产和应用。国外的研究表明,用含宿主细胞的YP培养基保藏蛭弧菌,在4个~8个月内仍有一定活性。国内的研究表明,在4℃条件下,用自来水宿主软琼脂保藏时,至少可存活3个月以上;黄文等人用4℃甘油、4℃NB液、平板、-20℃甘油和冷冻干燥等5种方法保蒇蛭弧菌,发现冷冻干燥法最好,21个月的复洗率达100%,且复活后的形状和噬菌特性不变;其次为-20℃甘油NB液保存法,17全月的复活率为67%;其它方法的保存时间也平均超过3个月。蛭弧菌的噬菌条件大量研究表明,蛭弧菌对pH、温度等环境因子的要求并不严格。邵桂元等人作了鱼病蛭弧菌的微生态学初步研究,发现蛭弧菌Bds-4等菌株在4℃~37℃和pH6.0~8.0的条件下。对点状产气单胞菌有形成噬菌斑的能力。李戈强等人经研究指出,蛭弧菌在温度10℃~35℃和pH6.5~8.1的范围内,对河流蛭弧菌均有裂解作用;在25℃~30℃和pH6.5~8.1时的裂解作用最强。马志宏等人也经过研究认为蛭弧菌对环境条件的适应性强,对温度和PH的适应范围较广。蛭弧菌的除菌效果秦生巨等人的研究认为,蛭弧菌在河水中21天后,可使不凝集弧菌由4.46×106个/mL降到27个/mL。杨莉等人的研究结果发现,蛭弧菌对鲤鱼感染嗜水气单胞菌的裂解效果,蛭弧菌在5天后使嗜水气单胞菌的浓度下降了103cfu/mL,9天后下降了107cfu/mL。说明蛭弧菌的除菌效率高。蛭弧菌的安全性迄今为止,已有一些报道说蛭弧菌对人和某些动物无害。薛恒平、秦生巨等人曾报道蛭弧菌能够促进仔鸡生长,提高增重率;冯晓英等的研究表明,在注射0.02mL浓度为8×105pfu/mL的蛭弧菌后,观察72小时,实验小鼠全部存活,无任何病态,生长良好;Byrd等人也认为,蛭弧菌对人无致病性。但蛭弧菌对水产动物的安全性尚未进行更多的研究。二、蛭弧菌的科研现状国外的研究自1962年stolp和Petzlod首次研究蛭弧菌以来,国外学者对蛭弧菌的生态学和生物学特性等已开展了大量研究。Shilo等人于1965年就对蛭菌的形态学展开了研究;其后的Starr等人在蛭弧菌分子生物科学家特性方面进行了研究;最近的Lambert、Martin、Nunez、Rendulic等人在蛭弧菌的裂解机制及其生活周期的动力学方面取得重大研究进展。国外学者的主要研究方向有:蛭弧菌基因及相关蛋白在生活周期中特性与功能,如淀粉酶基因、cya和类crp基因、MCP基因、丝氨酸蛋白酶和转运蛋白、外膜蛋白。蛭弧菌种间变异的研究,如外膜蛋白、脂多糖、16sDNA序列、细胞大小、形状、噬菌斑大小、生长能力、染色情况、对宿主的敏感性等。借助原子力显微镜对蛭弧菌109J裂解宿主世界语的动力学研究。环境因素对蛭弧菌存活周期的影响,如重金属镉、苯酚、尿素等。从分子水平对蛭弧菌进行鉴定的研究PCR引物的设计等。国内的研究我国对蛭弧菌的研究起步较晚。1982年,司稚东等人开展了蛭弧菌的系统性研究,在生物学特性、培养保藏方法、生态学及污水净化等方面取得很多成果;此后大批科研工作者开展了相关研究:如吴承龙等人研究了蛭弧菌某些生物学特性——形态、对不同宿主菌的裂解活性等;秦生巨、黄文等人研究了蛭弧菌保藏方法——冷冻干燥法、4℃营养肉烫液保藏法、-20℃甘油保藏法;赵孝先等人研究了蛭弧菌在细胞匀浆中增殖——大肠杆菌、大豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌匀浆液培养蛭弧菌;邵桂元等人研究了蛭弧菌最适培养条件——温度、pH等;杨淑专、李戈强、马志宏、杨莉等人分别研究了蛭弧菌对虾类致病菌——肠型点状气单胞菌、荧光假单胞菌、鳗弧菌等的裂解作用,用注射注解和浸泡感染方式研究蛭弧菌对欧洲鳗细菌性疾病的防治及其水质指标——pH、总硬度、浊度、生物耗氧量等。这些研究为蛭弧菌在水产养殖病害防治中的应用奠定了重要理论基础。但到目前为止,尚有一些问题有待进一步研究。一是蛭弧菌的噬菌机制尚未阐明。二是蛭弧菌生态学研究不够深入。三是蛭弧菌长效稳定的保藏方法不够全面。四是缺乏水体污染物对蛭弧菌影响的研究。五是缺乏蛭弧菌合理使用或测水施用的研究。六是有待研究高效专一的蛭弧菌及其制剂。七是有待加强蛭弧菌制剂的新剂型等。三、蛭弧菌的发晨前景目前,蛭弧菌已在我国商品化生产,并在水产养殖业中广泛应用。其主要生产单位和产品有:宝来利来兽药饲料公司的淡水水产动物专用噬菌26,广东省新的生物工程研究所有限公司的复合噬菌蛭弧菌,南京威力克生物有限公司的鱼虾宝、蟹宝、鳝宝、蛙宝、鳗鱼宝、虾宝,南京福润德动物药业有限公司的三联噬菌皇,SPSinc.燕金科技发展有限公司的百得菌、噬菌蛭弧菌多株冻干粉型活菌制剂,江苏省海洋水产研究所的克菌1号——噬菌蛭弧菌生态制剂,南京行安科贸有限公司的解毒养水宝,北海兰大生物科技公司的鱼虾神等。蛭弧菌在水产养殖业中应用前景十分广阔。主要用途有:一是蛭弧菌是我国水产养殖动物病害生物防治的一种新工具,利用蛭弧菌控制和减少池塘中细菌性疾病发生。二是蛭弧菌是水产养殖水体的生物改良剂,利用蛭弧菌对水体中细菌的裂解作用,去除有害于水产养殖动物的致病菌,降低氨氮含量,改善养殖水体环境,减少鱼病的发生。与光合细菌合用,还有控制养殖水体的COD、硫化物等作用。三是蛭弧菌是细菌性疾病防治的“活性抗生素”,因为蛭弧菌能裂解一些异养细菌,使养殖水体中的水产养殖动物致病菌浓度大大降低,进而降低了细菌性疾病的发生率。四、蛭弧菌在水产养殖业上的应用目前,国内外关于蛭弧菌在水产养殖业上的应用研究多侧重于对环境水体的净化和水产养殖动物细菌性疾病防治两个方面。水体净化秦生巨等人在自然河水中加入2.6×103cfu/mL噬菌蛭弧菌Bd81,并观察水质的变化情况,在48天的观察期间,水质的温度与细菌总数明显下降,而蛭弧菌的含量增加2倍~7倍,其它理化指标亦有所改变。王丽娜等人发现蛭弧菌的含量常后于水体污染,并且污染后,蛭弧菌可以在较长时间内维持高水平。一特性可以指示水体污染的新旧及是否遭到连续污染。余倩等人对成都市的5条主要河流中的噬菌蛭弧菌进行了调查,发现蛭弧菌普遍存在,且噬菌蛭弧菌的含量与污染程度有关,污染越严重则含量越高。疾病防治何义进等人对加入蛭弧菌的试验组与未加入蛭弧菌的对照组进行比较后,发现试验组成活率比对照组高19.4%~15.5%,未发生爆发性细菌性鳗病。杨莉等人用不同浓度的蛭弧菌投入于水族箱中,对鲤用泡法进行人工感染气单胞菌(Aeromonashydropila简称SC)试验,结果表明,蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解作用,对水体中氨氮有一定的降解作用,并对鲤鱼感染嗜水气单胞菌所致爆发性出血病有明显的预防作用。黄冬菊等人在试验中发现噬菌蛭弧菌对海水中的弧菌有强烈的捕杀清除作用。陈有长等人用有益微生物(光合细菌和蛭弧菌混合物)在中华绒螯蟹养殖中发现,试验组比对照组池塘中的细菌总数呈几何数量级下降,氨氮、硫化物含量及COD都明显减少,成活率分别提高了11.3%、13.5%和13.3%,并指出,使用噬菌蛭弧菌的浓度为107cfu/mL和光合细菌的浓度为109cfu/mL均为5mL/m3较为理想。曾地刚等人采用噬菌蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰细菌性败血病时试验,结果显示,在试验水体中同时加入噬菌蛭弧菌和嗜水气单胞菌,当水体中的噬菌蛭弧菌浓度达到105/mL以上时有预防效果。采用背部肌肉注射嗜水气单胞菌的方法,使斑点叉尾鱼回感染,然后在水体中加入噬菌蛭弧菌,结果是试验鱼全部死亡,说明噬菌蛭弧菌不能起到治疗斑点叉尾鱼回败血病的作用。徐琴等人将球形红假单胞菌、噬菌蛭弧菌及粘红酵母用于中国对虾幼体培育水体,试验结果表明。与对照组相比,试验组的成活率、变态指数、体长均匀增长率、酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力均优于对照组。试验结束后,试验组比对照组的细菌总数降低了三个数量级,添加噬菌蛭弧菌的组在减少异养菌方面有较好效果。同时用鳗弧菌攻毒,在5天内,对照组的死亡率明显高于试验组,试验组免疫保护率为29.4%~58.5%,以噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌试验组最为显著,使用浓度以2×105cfu/mL为好。韩韫等人用从海洋中分离出来的4株蛭弧菌作为生物净化因子,对16株常见海产品潜在的食源性致病弧菌进行裂解试验,发现4株同时使用,可裂解15株弧菌,裂解率高达93.9%。药物对蛭弧菌生长和吸附的影响恩诺沙星(Enrofloxacin简称EF).是第三代喹诺酮类药物,已广泛用于我国水产动物细菌性疾病的防治。由于养殖生产者缺乏科学用药知识,在进行水产养殖病害防治用药时,往往超剂量使用恩诺沙星,势必会影响蛭弧菌的生存。为此,曹海鹏等人研究了恩诺沙星对晴纶弧菌生长及吸附的影响。研究结果表明,在固体培养条件下,恩诺沙星对蛭弧菌BDF-H16噬菌斑的产生具有抑制作用,而且随着恩诺沙星浓度的升高,抑制作用越大;在液体培养条件下,蛭弧菌BDF-H16的增殖浓度随着恩诺沙星浓度的增高而降低。但10ug/mL恩诺沙星并没有改变蛭弧菌的生长趋势;而当在液体培养基中添加沸石时,蛭弧菌的吸附量随恩诺沙星含量的增加而逐渐降低。水质因子对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌的影响上海水产大学的钱云云和曹海鹏进行了“水质因子对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌的影响”研究,结果如下:1、温度:在温度为15℃~33℃条件下,蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌均能裂解,最适裂解温度为28℃,低温不利于蛭弧菌对嗜水气单胞菌的裂解。2、pH:在pH5.5~9.0的条件下,蛭弧菌BDF-H16对嗜好水气单胞菌均能裂解,裂解活性最高的pH为7.0~7.5,而在pH5.5~6.5和pH8.5~9.0时的裂解活性相对较低。3、Ca2+:在Ca2+浓度0~5.0mmol/L范围内时,对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定促进作用,以Ca2+浓度为0.5mmol/L时的裂解活性最高,而当浓度达10.0mmol/L时,裂解活性开始下降。4、Mg2+:当Mg2+浓度在2~2.0mmol/L时,蛭弧菌对裂解除嗜好水气单胞菌具有一定促进作用,Mg2+浓度为0.5mmol/L时的裂解活性最高,当Mg2+浓度大于5.0mmol/L时,裂解活性开始降低。5、NH4+:NH4+浓度对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定影响,情况是随着NH4+浓度的升高,蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌的裂解活性降低。当NH4+浓度在0.2mg/L时,产斑数目较对照组少23.0%而当NH4+浓度为0.8mg/L时,产斑数较对照组少64.7%。N02-:N02-对蛭弧菌裂解嗜好水气单胞菌也有一定影响。当N02-浓度在0.05mg/L~0.30mg/L时,对裂有一定促进作用,其中以浓度为0.30mg/L时的裂解活性最高,产斑数较对照组高1.6倍,但当浓度在0.5mg/L时,裂解活性开始下降,产斑数目降低为对照组的50.9%。蛭弧菌对有益微生物的裂解作用上海水产大学的张书俊和曹海鹏还进行了蛭弧菌对有益微生物的裂解研究,利用水产养殖上常驻用的酵母菌、枯草芽孢杆菌、硝化细菌作为宿主,同时以嗜好水气单胞菌为对照,除宿主菌为硝化细菌的双层平板没能形成噬菌斑外,其余均有噬菌斑产生,但有益菌相对于嗜好水气单胞菌的出斑时间明显常后,说明蛭弧菌对致病菌的裂解能力强;水中裂解实验验证。8天后酵母菌数目的对数值较起始值下降了0.59,枯草芽孢杆菌数目的对数值下降1.1,而嗜水气单胞菌下降了2.8。说明蛭弧菌致病菌的能力比非致病菌强,但也能影响水体中的有益菌存在,因此,在筛选水产用蛭弧菌时,应尽量筛选出对有益菌无裂解作用的菌株,并以此为筛选标准。